支原體常用培養基為PPLO，很多公司都有出售。但血清（常用馬血清或豬血清）和抗生素(醋酸跎)需要自己添加。

在液體培養基中通常要加入酚紅做指示劑的，當培養基由紅色變為黃色時，即可判定支原體的生長程度。需要注意的是，支原體的分離可能不太容易，需要多盲傳幾代。液體培養基變黃后，在固體培養基上單克隆，以純化分離的支原體。

一、支原體的培養條件

支原體的培養37°C即可。初次分離培養時，在37°C，5-10% CO2條件下效果更好。

二、支原體的鑒定

主要靠菌落染色、生化反應及特異性生長抑制試驗等。

（1）Dienes菌落染色

Dienes染色液：

美藍：2.5g

天青-II：1.5g

麥芽糖：10g

碳酸鈉：0.5g

蒸餾水：100ml

染色時，直接吸染色液覆蓋菌落，1min后，用生理鹽水洗去染色液，低倍鏡下可見支原體菌落呈藍色，而其他菌菌落不著色。

（2）生化反應

根據不同采樣部位及對底物的分解或者作為能源，可以鑒別不同支原體。

解脲支原體分解尿素不分解精氨酸，生成NH3使培養基的ph升高，酚紅指示劑變紅。

人型支原體分解L－精氨酸不分解尿素，生成NH3使PH值升高，酚紅指示劑變紅。

肺炎支原體分解葡萄糖，使pH降低，酚紅指示劑由紅變黃。

（3）在含0.002%美藍的培養基中肺炎支原體能生長且將美藍還原而退色，其他口腔、唾液或發酵支原體均被抑制生長，此法可鑒定肺炎支原體。

三、常用的支原體培養基配方

（1）基礎培養基

Hayflick培養基（PPLO培養基），牛心粉50g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，加14g瓊脂粉為固體培養基。

（2） 肺炎支原體培養基

基礎培養基 70ml

牛血清 （滅活） 20ml

25%的酵母浸液 10ml

50%葡萄糖 1－2ml 0.4

酚紅 0.5ml

制霉素 0.001g

青霉素 10萬IU

pH 7.8

（3）人型支原體培養基

基礎培養基 70ml

馬血清 20ml 25％的酵母浸液 10ml

30% L－精氨酸 0.33ml

0.4%酚紅 0.5ml

制霉素 0.001g

青霉素 10萬IU

pH 6.3

（4）解脲支原體培養基

基礎培養基 70ml

馬血清 20ml

25%的酵母浸液 10ml

30%尿素0.33ml

0.4%酚紅 0.5ml

制霉素 0.001g

青霉素 10萬IU

pH 6.0

注：支原體能在人工培養基上生長，但是營養要求較高，需要提供膽固醇和酵母才能生長。以上配方中，馬（牛）血清提供膽固醇，酵母浸液提供酵母。